重组人PKM2蛋白的生产起始于基因克隆。将人源PKM2 cDNA插入表达载体，如pET系列，并转化至大肠杆菌宿主。优化诱导条件以较大化表达量，通常使用IPTG诱导。
细胞裂解后，进行初步粗提。利用超声或高压匀浆破碎细胞，离心收集上清液。该步骤需低温操作，避免蛋白降解。
纯化阶段采用多步层析。首先亲和层析捕获His标签蛋白，随后离子交换和凝胶过滤精纯。最终纯度通过HPLC监测，有助于去除杂质。
活性检测包括酶联反应，测定ATP生成速率。内毒素去除使用特定树脂，符合制药级要求。
整个流程需在无菌环境中进行，产量可达克。